摘要：目的 探讨白花蛇舌草总黄酮（FOD）对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖、凋亡及干性的影响。方法 培养MDA-MB-231细胞系，分别用0、100、200、400 μg/mL FOD作用MDA-MB-231乳腺癌细胞不同时间（24、48、72 h），CCK8（Cell Counting Kit-8）法检测其对细胞增殖的影响；平板克隆试验检测各组MDA-MB-231细胞增殖能力变化；Annexin V-PE/7-AAD法检测各组MDA-MB-231细胞凋亡比例，并用Western blotting法检测Bcl2、Bax及凋亡指标cleaved-caspae3等凋亡通路蛋白的表达，流式细胞检测CD44+/CD24-乳腺癌细胞干性，并用Western blotting法检测干性肿瘤指标Nanog、Sox2、Oct4的表达量。结果 CCK8实验显示，400 μg/mL FOD作用72 h（FOD组）后细胞增殖较阴性对照组（DMSO组）受到明显抑制（Plt;0.05）；平板克隆试验显示，药物干预组细胞增殖下降（Plt;0.05）；经400 μg/mL FOD处理的MDA-MB-231干性标志物Nanog、Oct4、Sox2表达更低（Plt;0.05）。流式细胞仪检测FOD组细胞凋亡比例较阴性对照组明显升高（Plt;0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，而促凋亡蛋白Bax及凋亡指标cleaved-caspae3的蛋白表达升高，FOD处理后乳腺癌细胞增殖、凋亡及干性改变，通路蛋白Akt及GSK3β磷酸化受到抑制，β-catenin表达降低。结论 FOD可明显抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖及干性，促进细胞凋亡。
关键词：乳腺癌；干细胞；白花蛇舌草总黄酮；增殖；凋亡
中图分类号：R735.7
文献标志码：A
DOI：10.7652/jdyxb202306006
Effect of total flavone of oldenlandia diffusa on the proliferation，
apoptosis and stemness of breast cancer MDA-MB-231 cell lines
YAO Bowen1， LI Yazhao2， LI Jingyu3， LI Chaoyi3， LU Ye1， MA Jiequn4， ZHANG Yanbing4
（1.Department of Hepatobiliary Surgery， The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，
Xi’an 710061; 2. Center for Tranlational Medicine， The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong
University， Xi’an 710061; 3. Zonglian College， Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710061;
4. Department of Oncology， Shaanxi Provincial Cancer Hospital， Xi’an 710061， China）
ABSTRACT： Objective To investigate the effect of total flavone of oldenlandia diffusa（FOD） on the stemness， proliferation and apoptosis of breast cancer（BC） stem cells sorted from MDA-MB-231. Methods Human BC cell lines MDA-MB-231 was cultured in vitro; MDA-MB-231 was stimulated by different concentrations（0 μg/mL， 100 μg/mL， 200 μg/mL and 400 μg/mL） of FOD for different time （24 h， 48 h and 72 h）. CCK8 and plate cell cloning assay were used to detect the effect of FOD on MDA-MB-231 proliferation; CD44+/CD24-MDA-MB-231 cell line were tested by flow cytometry and stem cell markers such as Nanog， Oct4 and Sox2 were tested by Western blotting; Annexin V-PE/7-AAD was used to detect the effect of FOD on MDA-MB-231 apoptosis and Bcl2， cleaved-caspase3 and Bax were tested by Western blotting. Results Cell proliferation of MDA-MB-231 was significantly inhibited by FOD，with the significant suppression at concentrations of 400 μg/mL for 72 h compared with negative control group（Plt;0.05）. The apoptosis rate was significantly upregulated than the negative control group （Plt;0.05）. The protein expression of Bcl2 decreased while Bax and cleaved-caspae3 increased， and stemness markers such as Nanog， Sox2 and Oct4 decreased in FOD-treated cells. Moverover， Akt-GSK3β-β-catenin axis was inhibited in FOD-treated cells. Conclusion FOD could significantly inhibit the stemness and proliferation and promote the apoptosis of MDA-MB-231.
KEY WORDS： breast cancer; stem cell; total flavone of oldenlandia diffusa （FOD）; proliferation; apoptosis
乳腺癌（breast cancer，BC）是全球常见的恶性肿瘤之一，困扰女性的身心健康，是导致全球女性癌症死亡的主要原因，发病率逐年上升[1]。这与乳腺癌的过度增殖、细胞干性增强和抗凋亡特性密切相关[2]。
乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells，BCSCs）是乳腺癌中出现的一小部分未分化且具有一定自我更新、分化和肿瘤发生能力的肿瘤细胞，在临床中与肿瘤的增殖、转移、复发及化疗耐药等恶性进程有密切的相关性。目前已被明确鉴定出的乳腺癌干细胞标志物包括CD24抗原、CD44抗原、整合素亚单元A6（ITGA6或CD49f）、醛脱氢酶（ALDH），以及上皮细胞黏附分子（EpCAM）等[3-7]。其中，CD44+/CD24-型是乳腺癌干细胞常见的类型，通常用于筛选鉴别MDA-MB-231细胞中的乳腺癌干细胞。
白花蛇舌草（hedyotis diffusa Willd）是茜草科耳草属植物，其重要的活性提取物之一是白花蛇舌草总黄酮（total flavone of oldenlandia diffusa， FOD）。根据前期的研究结果得知，FOD对肝癌的增殖及上皮间质转化的抑制作用明显[8-9]，同时对肺癌细胞、结肠肿瘤细胞等也具有抑制作用[10-12]。研究表明，乳腺癌恶性进展及耐药与其干性表型明显相关，其中同源盒转录因子（homeobox transcription factor nanog， Nanog）、八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor 4， Oct4）、SRY-box 转录因子2（SRY-box transcription factor 2， Sox2）等参与干性表型和化疗抵抗[13-19]。因此，BCSCs的比例决定乳腺癌的治疗转归，具有重要研究价值。
目前对FOD参与乳腺癌恶性行为的研究报道较少。本研究旨在对乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行FOD药物干预，探究FOD药物刺激对MDA-MB-231乳腺癌细胞干性、增殖及凋亡水平的影响，使FOD为临床中乳腺癌的治疗提供新的治疗方案和研究基础。
1 材料与方法
1.1 试剂
MDA-MB-231细胞为中国科学院细胞库所提供，用于细胞培养的DMEM（高糖培养基）及细胞胰酶和胎牛血清（Fetal Bovine Serum， FBS）购自Hyclone。CD24和CD44的流式抗体购自biolegend。青霉素-链霉素-两性霉素B溶液、细胞蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒和BSA（牛血清蛋白）等试剂均购自碧云天生物试剂公司。CCK-8检测液和ECL（增强型化学发光）发光液购自新赛美生物公司。使用BD公司的Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒检测凋亡。一抗β-肌动蛋白（β-actin）、B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2， bcl-2）、Nanog、胱天蛋白酶3（Caspase3， CASP3）、cleaved-caspase3及二抗购自武汉三鹰公司，BCL2相关蛋白X（BCL2 associated X， Bax）、Oct4、Sox2一抗购自Santa Cruz公司，蛋白激酶B （protein kinase B， Akt）、磷酸化蛋白激酶B （phosphorylated protein kinase B， p-Akt）、β-连环蛋白（β-catenin）、糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK3β）、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（phosphorylated glycogen synthase kinase 3 beta，p-GSK3β）一抗购自Immunoway公司。
1.2 细胞培养
将冻存的MDA-MB-231细胞放置在水浴锅（37 ℃）中迅速地进行复苏，在此之后，快速地转移到10 mL DMEM高糖培养基中，其中含有100 mL/L胎牛血清。轻微晃动使细胞混匀后，将细胞转移至细胞培养皿培养。等待细胞生长，直至达到约90%的细胞融合度时，用细胞胰酶消化处理1 min，等体积完全培养基中和消化作用。1 000 r/min转速离心5 min，弃去上层清液，轻柔地沉淀重悬细胞，最后进行1∶3 的传代操作。
1.3 细胞免疫荧光染色
将MDA-MB-231细胞培养至约80%的细胞融合度后，使用胰酶将其消化成单细胞悬液。通过磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）对细胞进行两次漂洗操作，去除培养基。操作完成后，向培养皿的细胞中再次加入100 μL的PBS溶液，将细胞重新悬浮，并加入5 μL的CD24和CD44抗体。在37 ℃下避光孵育细胞悬液30 min。完成孵育后，再次使用1 mL的PBS溶液将细胞重悬，并使用单细胞筛网进行过滤。最后，采用流式细胞仪检测细胞中CD24和CD44阳性细胞的比例。
1.4 CCK-8（Cell Counting Kit-8）法检测细胞增殖抑制率
500/孔的密度标准将纯化的MDA-MB-231细胞加入96孔板中，并置于细胞培养箱中过夜培养促使其贴壁。使用DMSO溶解FOD，并设置不同浓度（0、100、200、400 μg/mL）的FOD干预，时间为24、48 h和72 h，然后进行CCK-8实验检测。向每孔中加入10 μL CCK-8检测液，37 ℃孵育2 h，多功能酶标仪对A450 nm的吸光度值进行测定。使用以下抑制率公式计算抑制率（其中对照组记为control，即只加入细胞而无药品加入；空白对照组记为blank，即细胞和药品均未加入；加入细胞和药品的检测组记为sample）。抑制率（%）=（Acontrol - Asample）/（Acontrol -Ablank）×100%。
对MDA-MB-231干细胞进行处理，使用不同剂量（0、100、200、400 μg/mL）完成处理操作。根据细胞生长抑制率曲线，最终得到较合适浓度的FOD处理组（400 μg/mL）作为实验组（后文称为FOD组），而将0 μg/mL FOD处理组作为对照组（后文称为DMSO组）。
1.5 平板克隆试验
取对数生长期的FOD组和DMSO组MDA-MB-231细胞每孔种入1 000个细胞，在6孔培养板中培养10" d。弃去细胞培养基后，使用PBS溶液轻柔地进行2次细胞冲洗，并吸干冲洗后的残余液体。在每孔中加入2 mL 10%甲醛溶液固定细胞20 min，弃去固定液使用PBS溶液轻柔地清洗2次。加入结晶紫溶液染色10 min。进行5次前述的清洗过程。将培养板风干，在显微镜下计算细胞数量。
1.6 Annexin V-PE/7-AAD法检测细胞凋亡
首先，同前步骤消化细胞获得单细胞悬液，然后进行2次PBS溶液的漂洗。将细胞重悬于适当浓度的binding buffer中，并分别向两组细胞中加入5 μL Annexin V-PE及7-AAD。在37 ℃避光条件下孵育细胞30 min后，加入500 μL稀释后的binding buffer。通过流式分析仪检测并分析细胞，再使用单细胞筛网进行细胞过滤操作后完成。
1.7 Western blotting检测相关蛋白表达
收集FOD组和DMSO组细胞分别用蛋白裂解液提取总细胞蛋白，使用BCA法检测蛋白浓度。对蛋白进行变性处理，进行SDS-PAGE电泳，将其转移到PVDF膜上。使用BSA进行封闭处理，一抗为细胞凋亡标志物Bcl2、Bax及cleaved-caspase3、Nanog、Sox2、Oct4细胞干性标志物，以及通路蛋白Akt、p-Akt、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β，二抗孵育后，进行ECL发光。
1.8 统计学处理
使用SPSS v19.0和GraphPad作图软件分析。在对实验数据进行汇总后，对A值、蛋白电泳条带的扫描灰度、凋亡细胞的百分比及平板克隆细胞集落数等计量资料，对数据进行正态性检验后采用t检验或者秩和检验。将差异统计学意义设置为Plt;0.05。
2 结果
2.1 FOD对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的影响
细胞生长抑制率结果显示，不同浓度的FOD（0、100、200、400 μg/mL）对MDA-MB-231乳腺癌干细胞刺激不同时间后，均能观察到一定程度的细胞增殖抑制效果。在使用400 μg/mL的FOD刺激MDA-MB-231乳腺癌干细胞72 h后，细胞增殖水平的受抑制程度最为明显（**Plt;0.01，图1）。平板克隆试验结果显示，FOD处理组（400 μg/mL）的MDA-MB-231细胞增殖能力降低（**Plt;0.01，图2），左侧为平板克隆两组处理代表图，右侧为重复试验后统计柱状图。
2.2 FOD对MDA-MB-231乳腺癌细胞凋亡的影响
Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测结果显示，DMSO组MDA-MB-231细胞的凋亡比例为（3.877±0.39）%，FOD组的凋亡比例为（10.133±0.82）%。400 μg/mL的FOD作用MDA-MB-231细胞凋亡水平明显升高（图3A）。后续通过Western blotting实验检测了凋亡相关指标蛋白的表达，FOD处理后乳腺癌细胞Bcl2蛋白表达明显下降，而提示促进凋亡的蛋白家族成员，包括Caspase3、Bax明显上调（Plt;0.05，图3B）。
以上结果提示，使用400 μg/mL的FOD能够促进 MDA-MB-231细胞凋亡。
2.3 FOD对MDA-MB-231乳腺癌细胞干性的影响
流式细胞仪检测经细胞免疫荧光染色后的乳腺癌细胞，检测结果显示，DMSO组CD44+/CD24-MDA-MB-231细胞比例为（93.133±2.588）%，FOD组的比例为（75.412±6.277）%。400 μg/mL的FOD作用MDA-MB-231细胞干性明显降低（图4A）。后续通过Western blotting实验检测了干性相关指标蛋白的表达，FOD处理后乳腺癌细胞干性指标Nanog、Oct4及Sox2明显下降（Plt;0.05，图4B）。
以上结果提示，使用400 μg/mL的FOD能够抑制 MDA-MB-231细胞干性。
2.4 FOD参与MDA-MB-231乳腺癌细胞恶性行为通路
为进一步探究FOD引起MDA-MB-231细胞增殖、干性及凋亡改变的上游通路，Western blotting结果显示，FOD可以明显抑制Akt、GSK3β的磷酸化，从而影响β-catenin（图5）。因此推测，FOD可能通过Akt-GSK3β-β-catenin通路抑制乳腺癌细胞恶性行为。
3 讨论
乳腺癌是一种在世界范围内具有极高致死率的恶性肿瘤，因其肿瘤异质性导致治愈难度增大。近年来，其发病率也在世界范围内逐年上升[3]。作为困扰女性健康的恶性肿瘤，多数患者存在化疗、放疗抵抗而影响治疗效果[4-6]。目前切除联合高危人群的化疗及局部放疗极大增加了保乳乳腺癌切除患者的比例，然而，手术理念的进步离不开化疗及放疗的敏感性[13-15]，因BCSCs的存在，导致大多数中晚期无法行手术切除的患者，也难以得到理想的治疗。
因此，为解决乳腺癌治疗耐药等问题，并提高患者生命质量，针对抑制乳腺癌干细胞的探究需重点关注。本研究发现，FOD抑制乳腺癌恶性行为学，并首次初步探讨抑制细胞增殖、干性及促进其凋亡的潜在作用，为解释FOD体外明显的抗癌作用奠定了理论基础。然而，肿瘤细胞的干性、增殖及凋亡水平受多种因素影响，并且肿瘤微环境和物理化学刺激等外部因素也对其凋亡产生调节作用[15-18]。针对这些影响因素，有必要进一步开展严谨的科学实验，以探究增殖和干性下降及凋亡增加是否仅由FOD单一因素引起。在后续的研究中，本研究团队计划验证FOD是否在与靶向药物、化疗药物、免疫治疗药物等联合治疗中，能对耐药细胞的杀伤率有所提高。
FOD是从白花蛇舌草中提取的重要活性物质之一，已经确认它对肺癌细胞的增殖、凋亡和细胞周期产生一系列影响[10]。此外，它还被发现通过Wnt信号通路抑制结肠肿瘤干细胞的分化过程，并在结肠癌中通过调节Wnt/β-catenin通路对干细胞的生长产生抑制效果[11]。然而，目前尚未有关于FOD对于乳腺癌细胞的影响报道。目前我国医学研究事业发展迅猛，解决关键技术难题的中坚力量也已逐渐转变为中西医结合理念及产品。而作为一种来源丰富且易得的植物药材，白花蛇舌草对正常肝细胞的毒性危害较小，同时对肿瘤细胞有明显的抑制作用。在临床中联合使用FOD具有一定的治疗作用和较高的性价比。
本研究采用FOD刺激乳腺癌细胞，并观察其对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖、干性及凋亡的影响。结果表明，FOD对MDA-MB-231乳腺癌干细胞增殖的抑制效果在剂量和时间依赖性上均有体现。同时，FOD也可通过对抗凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax的表达，使其细胞凋亡水平明显升高。这为FOD在治疗复发型、转移型及耐性药型BC方面提供理论依据。我们后续验证了乳腺癌的干性指标[13-19]，实验证实FOD亦可以明显抑制乳腺癌细胞的干性表型，明显降低干性细胞的比例，降低Nanog/Sox2/Oct4的表达。对于乳腺癌细胞的凋亡、干性及增殖表型，Akt-GSK3β-β-catenin通路在其中发挥作用。然而，FOD对乳腺癌细胞恶性行为的机制通路尚不明晰，有关具体参与的靶点及分子机制将在后续的研究中揭示。
简言之，FOD明显抑制乳腺癌恶性行为，并通过Akt-GSK3β-β-catenin通路明显降低其增殖活性和干性比例，促进其凋亡，为中西医结合抗肿瘤治疗提供新的理论依据。
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（编辑 卓选鹏）
